离子交换层析法大致分为5个步骤：1.      离子扩散到树脂表面。2.      离子通过树脂扩散到交换位置。3.      在交换位置进行离子交换；被交换的分子所带电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不容易被其它离子取代。4.      被交换的离子扩散到树脂表面。5.      冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。 离子交换树脂的交换反应是可逆的，遵循化学平衡的规律，定量的混合物通过管柱时，离子不断被交换，浓度逐渐降低，几乎全部都能被吸附在树脂上；在冲洗的过程中，由于连续添加新的交换溶液，所以会朝正反应方向移动，因而可以把树脂上的离子冲洗下来。如果被纯化的物质是类的分子，则分子上的净电荷取决的等电和溶液的pH值，所以当溶液的pH 值较低，分子带正电荷，它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上；随着通过的缓冲液pH逐渐增加，将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被洗下来。由于不同的等电不同，这些将依次被洗出，最先被洗出的是酸性，如apartic acid和glutamic acid（在约pH3~4时），随后是中性，如glycine和alanine。碱性如arginine和lysine在pH值很高的缓冲液中仍带有正电荷，因此这些在约pH值高达10~11时才出现。